熒光分光光度計同步熒光法按光譜掃描方式的不同可分為恒(固定) 波長法、恒能量法、可變角法和恒基體法。

1. 恒波長同步熒光分析法

恒波長同步熒光法系在掃描過程中使激發(fā)波長和發(fā)射波長彼此間保持固定的波長間隔(Δλ= λem- λex = 常數(shù)) ,即通常所說的同步熒光法,是最早提出的一種同步掃描技術(shù)。在恒波長同步熒光法中,Δλ的選擇十分重要,這將直接影響到同步熒光光譜的形狀、帶寬和信號強度。在可能條件下,選擇等于斯托克斯位移的Δλ。

恒波長同步熒光光譜法較多用于多組分多環(huán)芳烴的同時測定。多環(huán)芳烴性質(zhì)很相似,盡管有強的熒光,但各種化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜往往光譜重疊嚴重,用經(jīng)典熒光法難以進行混合物的直接分析。同步熒光法具有選擇性好、靈敏度高、干擾少等特點,可用于多組分多環(huán)芳烴混合物的同時測定。

2. 恒能量同步熒光分析法

恒能量同步熒光光譜法(CESLS) 由Inman 和Winefordner 于1982 年提出。它在克服拉曼光、提高分析靈敏度方面均有顯著效果,具有其他同步熒光法所沒有的獨特優(yōu)點。恒能量同步熒光法系在激發(fā)波長λex和發(fā)射波長λem的同時掃描過程中保持兩者一恒定的能量差Δ€v 關(guān)系。該法以熒光體的量子振動躍遷的特征能量為依據(jù)來進行同步掃描,若選擇一固定能量差Δ€v 等于某一振動能量差,則在同步掃描中,當激發(fā)能量和發(fā)射能量剛好匹配一特定吸收2發(fā)射躍遷條件時,該躍遷處于最佳條件,由此產(chǎn)生的同步光譜可達最大強度。恒能量同步熒光法對于多環(huán)芳烴的鑒別和測定特別有利。恒能量同步熒光法的光譜優(yōu)點可以以定量形式來表達并用來選擇掃描參數(shù),從而為體系的參數(shù)優(yōu)化提供了便利。

3. 可變角同步熒光分析法

可變角同步熒光法是在測繪同步光譜時,使激發(fā)和發(fā)射兩個單色器以不同的速率或方向同時掃描。該方法可分為線性與非線性兩類:線性可變角同步熒光法的掃描路徑表現(xiàn)在等高線圖中為一條不為45°的直線;而非線性可變角同步熒光法其掃描路徑表現(xiàn)在等高線圖中為折線或任意曲線。非線性可變角同步熒光掃描時,不但要求激發(fā)、發(fā)射兩個單色器能以不同的速率和不同的方向進行掃描。該方法能使掃描路徑方便地有選擇性地通過各點,因而獲得極佳的光譜分辨。李耀群等提出了利用可變角同步熒光法克服二次散射光干擾的設想,并且探討了適宜于包括可變角同步熒光光譜在內(nèi)的波長域同步譜的理論計算式。導數(shù)技術(shù)和可變角同步熒光法的聯(lián)用可進一步提高分析的靈敏度和選擇性

4. 恒基體同步熒光分析法1994 年Murillo2Pulgarin 等提出了恒基體同步熒光法。它也可被認為是非線性可變角同步熒光法的一種,其掃描路徑在等高線圖中表現(xiàn)為一曲線,巧妙的是該曲線是基體(將干擾物視為基體) 的等熒光強度線。該方法一般與導數(shù)技術(shù)聯(lián)用[113 ] ,沿著等高線掃描,再結(jié)合導數(shù)技術(shù)就可以消除基體的干擾。其基本原理是:在等高線圖上把基體的熒光強度相等的各點連接起來形成等高線(等熒光強度線) ,沿著基體的等高線掃描,則在整個掃描過程中基體的熒光強度相等。由于整個掃描過程基體的熒光強度一致,當結(jié)合導數(shù)技術(shù)微分后,基體的導數(shù)信號為零。在混合物中沿著測定路徑(干擾物或基體的等高線) 掃描時所得的信號通常是混合物的總的熒光信號,既包括待測物的信號,又包括干擾物(基體) 的信號。但由于是沿干擾物(基體) 的等高線掃描,熒光信號求導后,干擾物(基體) 的干擾就得到了消除,掃描所得的導數(shù)信號則是被測物的凈信號。

 

熒光分光光度計同步掃描技術(shù)是由Lloyd首先提出的,它與常用的熒光測定方法最大的區(qū)別是同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長。由測得的熒光強度信號與對應的激發(fā)波長(或發(fā)射波長) 構(gòu)成光譜圖,稱為同步熒光光譜。同步熒光法按光譜掃描方式的不同可分為恒(固定) 波長法、恒能量法、可變角法和恒基體法。